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MilliporeECL發光液哪些因素會影響信號的強弱呢?
瀏覽次數:181發布日期:2022-04-21
  MilliporeECL發光液以化學熒光發光方法檢測蛋白質或核酸類生物大分子。其原理是,蛋白質或核酸在電泳后轉移到印跡膜上,以抗體及辣根過氧化物酶HRP標記的第二抗體結合膜上的目的蛋白,或以HRP標記的探針直接或間接結合膜上的核酸。洗膜后用MilliporeECL發光液A液和B液等體積的混合工作液,在可見光下室溫孵育膜數分鐘,將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數秒到數分鐘至數小時。
 
  MilliporeECL發光液哪些因素會影響熒光信號的強弱呢?
 
  1.保鮮膜的質量。a.國產的保鮮膜,很多廠家偷工減料打價格戰,造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露,一方面ECL反應不充分,另一方面ECL所含液體會溶解試驗臺上殘留未知的化學藥品顆粒(也許你或其他人曾經不小心打翻過某種化合物)、灰塵等等,造成熒光淬滅。在簡述原理時,我曾經提到過很多化合物、金屬離子能直接催化過氧化物水解,在極短的時間內消耗掉所有的HRP酶,熒光轉瞬即逝。
 
  b.保鮮膜的化工原料或拉制過程中,殘留未知的化學試劑,引起熒光淬滅;廉價的保鮮膜問題尤多。
 
  目前,國產的就“妙潔”比較過關,保鮮膜厚度和化學物殘留都不影響ECL顯影。
 
  如果買不到合格的保鮮膜,也可以用其他物品替代;但要特別注意這些支持物表面的干凈,好不要有任何化學試劑殘留,包括風干的TBST鹽結晶顆粒。
 
  2.ECL孵育結束后膜需要控干。中學物理學過水會吸收光譜,因此任何液體包括ECL溶液本身都會干擾熒光強度,所以ECL孵育結束時需要控干。一般夾起膜,讓膜的一角或一邊接觸吸水紙;但是請注意不能讓膜完全干掉。某些信號較弱的ECL,膜徹底干掉后熒光會消失;較好的試劑盒,熒光相對穩定,但完全吸干以后,背景熒光也會升高,而且會嚴重影響重新標記新抗體時的背景。因此,按照我的方法,讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。
 
  3.控干的膜要仔細用保鮮膜包被,防止接觸外界異物造成熒光淬滅;同時,包裹保鮮膜時要細心,盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現皺褶。皺褶的地方會堆積多余的ECL,要么形成一條熒光的亮線;要么由于液體吸收熒光或者局部區域HRP過度消耗,呈線條狀淬滅。
 
  4.在膜放入壓片夾之前,好肉眼觀察一下熒光信號的強弱,這有利于判斷實驗可能出現的問題。很多人提問看見很強的熒光了,但怎么壓片都沒有信號,那么就是快速淬滅(閃滅,再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號)造成的;有這個觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實驗操作應該問題不大,而問題主要是淬滅。如果你省略這個步驟,那問題就非常復雜了,因為之前任何操作都可能導致白板,根本無法判斷。
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